細(xì)菌在普通培養(yǎng)基中保存一般需要 每月 傳
 
代一 次 , 而且容易發(fā)生污染和變異 。 保存菌種**理想的方法為冷凍干燥法 , 可 以保存幾 年、 幾十年或者更長的時(shí)間 , 而且可 以避免污染和變
 
異j[1  。  但是 ,    冷凍干 燥設(shè)備昂貴 ,     不是每一 個(gè)必
 
需的單位都能裝備上 ,  **使該法不能 普遍應(yīng)用 。
 
我們通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn) ,      利用超速離心機(jī)原有的低
 
溫 冷凍系統(tǒng)和真空 抽氣系統(tǒng) ,  不 加任何改裝 ,  可
 
以 完成冷凍干燥過程 ,  制備出冷凍干燥菌種 ,  效
 
果良好 提供了一個(gè)一機(jī)多用 的冷凍干燥方法。
 
1 材料和方法
L l _材料
 
^{.1 L l} 供試菌種 : 由中G藥品生 物制品檢定所菌種保存 中心提供 , 均為G際標(biāo)準(zhǔn)菌種 。
1. 1 .      2 培養(yǎng)_基:      _{普通營養(yǎng)瓊脂培}養(yǎng)_基。
 
1. 1 .       3 超速離心 機(jī) :      日立 08 P 一 7 型 超速離心 機(jī)
( _P r e  s  e r  v  a  t i v  e e e  n t r  i _f u  g e )
 
L L  4高頻探漏儀 :  G P I 型 ,  北 京儀器廠出品 。
 
.1  2    _方法
 
L ^{.2   1}   新鮮脫脂牛乳的制 備:   制備冷凍干燥菌
 
種需用脫脂牛乳作保護(hù)劑。 制備方法 : 取⁴ ℃ 保藏的新鮮牛乳一袋 ^, 3 0 0 o r / m i ⁿ 離心 沉淀 I O m i n 去除油脂層。 取此脫脂牛乳分裝于中試管 , 經(jīng) 0 . 7 0 k g c/ m ^“ 高壓蒸汽滅菌 , 塞上無菌膠塞 , 4 C 冰箱存放備用 。
 
¹ . ² .        ² 菌液制備:  將要冷凍干燥的菌種接種于
 
營養(yǎng)瓊脂斜面 ,      37  ℃ 培育18  一 24  h 。  刮取菌苔放人³一 ^s lm 無菌脫脂牛乳中制成濃菌液 ⁽ 每毫升約含 20 億個(gè)菌 以上 ) , 按0 . 1一。 . 2 m l 量分裝于安瓶管中 , 進(jìn)行冷凍干燥。
 
^{L  .2  3}    冷凍干燥操作程序:
 
( 1)  預(yù)冷 :   檢查機(jī)器 ,    將各轉(zhuǎn)鈕調(diào)置于 。位。
 
將 低限溫度指 針 ( 綠針) 調(diào)****低處 , 將高限溫度指針 ( 紅針 ) 調(diào)** 一 ^I O C 處 。 接上電源 , 打
 
開總開關(guān)和冷凍機(jī)開頭 , 使槽 內(nèi)溫度下降。 約 20 m in , 槽 內(nèi)溫度可 降** 一 03 C , 溫度指針 ( 黑
 
針 )  到達(dá)**低處。
 
(2 ) 菌種速凍: 當(dāng)槽內(nèi)溫度到達(dá)一 03 C 以下時(shí) , 啟開冷凍槽平蓋 , 迅速放人裝有牛乳菌液的 安瓶管 , 并蓋嚴(yán)平蓋 , 繼續(xù)冷凍h2 。
(3  ) 冷凍干燥 :      打開真空泵 ,      在一 03  C 下
 
抽 氣干燥h2  。  將低限溫度指針上調(diào)** 一 ⁴ ℃ ,     上
 
限 溫度指針上調(diào)** 十 ^S C , 繼續(xù)抽氣干 燥h2 。 將低限溫度指針上調(diào)** ^1 8 C , 上限溫度指針上調(diào)** 24 C , 繼續(xù)抽氣干燥4h , 冷凍干燥完畢。 每次
 
使用后 ,  部分水氣成為水珠下沉于油槽底部 ,  需
 
從油 槽下端換油 孔的透明膠管中放出 。  當(dāng)放盡
 
水珠后 ,     補(bǔ)上一 些新油即可再次使用 。
 
( )4  封^口 ,    加簽 :   關(guān)閉真空泵和冷凍機(jī) ,     打
 
開 冷凍槽平蓋 , 取 出凍干的安瓶管。 冷凍干燥 良好的菌種管原體積不變 , 呈白色干燥結(jié)構(gòu)。 將安
 
瓶 管逐個(gè)插人真空抽氣機(jī)的多頭皮管上 , 用本生燈或安瓶封 口 燈火焰逐支封 口 。 按菌種名稱
 和批號(hào)貼上標(biāo)簽 ,     置菌種盒于 ⁴ ℃ 冰箱保存待
用 。
 
( )5 檢測: 用 G P ^I 型高頻探漏儀探測每支菌種管的真空度。 真空 度良好的菌種管會(huì)發(fā)藍(lán)
 
色熒光。  探測時(shí)間不宜過長 ,       以免影 響菌種活
 
力。 活菌試驗(yàn) : 打開安瓶管 , 加人少量肉湯培養(yǎng)基 , 融化后取一滴接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上 , 或其他適宜培養(yǎng)基上 , 放 37 ℃ 溫 箱 中培育 24 一 ⁴ 8 h ^, 觀察細(xì)菌的存活情況及其純度。
2 結(jié)果和討論
 
2 .¹   超速離心機(jī)制備冷凍干燥菌種
 
兩 年中用此法冷凍干 燥 G際 標(biāo)準(zhǔn)菌種03
 
種 ^,    包括痢疾桿菌、    沙門氏桿菌、    假單胞菌、    埃
 
希氏菌、 鏈球菌、 亞 利桑那沙門氏菌等屬的細(xì)菌。 凍干保存一年后 隨機(jī)測 試了 18 種凍干的菌
 
種 ^,     即 ^:    志賀氏痢疾桿菌、    宋內(nèi)氏痢疾桿菌、    福
 
氏 痢疾桿菌、     傷寒桿菌、     腸炎沙門氏菌、     金 黃
 
色葡萄球菌、      甲型鏈球菌、     綠膿桿菌、     克雷伯
 
氏 肺炎桿菌、     致病性埃希氏大腸 桿菌、     亞利桑

那菌、  弗蘭地檸檬酸桿菌和 臘狀桿菌 。  結(jié)果全部
 
生長 良好 。
 
² . ² 超速離心機(jī)凍干其他生物制荊
 
實(shí) 驗(yàn)證明 ,      使用 此法將冷凍干燥時(shí)間延長
 
到 ^{1 4} h ,     還可 以凍干較大容量的各種生物制劑。
 
我們以人血清和 脫脂牛乳做試驗(yàn) ,       ⁵m l 安瓶裝
 
量 l m l ,      I O m l 安瓶裝量 Zm l ,     底面積 2 5 X  4 5 m m
 
的組織培養(yǎng)瓶裝量³ m l ,  底面積5  ^又 85  m m  的組
 
織 培養(yǎng)瓶裝量^1 0 m l ,    平放冷凍干燥¹ h4  ,    可 以制
 
出 良好的凍干產(chǎn) 品。
 
由于本機(jī)冷凍槽較大 , 真空泵效力較高 , 使用本機(jī)不僅可以凍干菌種 , 使之長期保存 , 而
 
且還適用于 中批量的凍干生物制劑的研究和生
產(chǎn) ,包括生物制劑 ,      生物藥品和其他生物制品
 
的 研究和生 產(chǎn)。  一機(jī) 兩用 ,      可 以節(jié)省 資金和 用
 
房 ,     提高機(jī)器的利用率。